Cách chẩn đoán bệnh DIV1 trên tôm nuôi

Chẩn đoán lâm sàng, mô bệnh học:

Do bệnh không có triệu chứng, bệnh tích điển hình và dễ nhầm lẫn với các bệnh khác nên việc chẩn đoán lâm sàng chỉ có tính hỗ trợ định hướng trong quá trình chẩn đoán, xét nghiệm bệnh. Ngoài ra, tôm càng xanh M. rosenbergii có thể được sử dụng như một loài chỉ thị cho các trường hợp nghi ngờ khi quan sát thấy mô tạo huyết có màu trắng điển hình ở các tôm bị bệnh (đầu trắng).

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm:
Sử dụng phương pháp sinh học phân tử (phát hiện sự có mặt của vi rút) mới có thể khẳng định bệnh do DIV1, cụ thể:

* Phương pháp Nested PCR (Qiu, 2017): Nested PCR được tiến hành theo 2 bước riêng biệt sử dụng 2 cặp mồi bắt cặp với gen ATPase của DIV1. Trong bước đầu tiên, PCR nhân đoạn gen có kích thước 457 bp. Bước thứ 2 đoạn 129 bp được nhân lên. Để nhìn được các đoạn gen được nhân lên, sản phẩm PCR (5 μL của mỗi loại) được nhỏ trên thạch agarose 1% chứa GeneFinder (Bio-V, China).

– Bước thứ nhất:
i) 25 μL hỗn hợp dung dịch cho phản ứng PCR gồm 2.5 μL of 10× Ex Taq Buffer (Mg2+ free), 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.4 μM primers (SHIV-F1: 5′ GGG CGG GAG ATG GTG TTA GAT-3′ and SHIV-R1: 5′-TCG TTT CGG TAC GAA GAT GTA-3′), 0.625 U TaKaRa Ex Taq DNA polymerase (TaKaRa, Dalian, Liaoning, China), và 1 μL mẫu DNA.
ii) Chạy ở chu trình nhiệt 950C for 3 phút, 950C trong 30 giây (35 vòng), 590C trong 30 giây và 720C trong 30 giây, 720C trong 2 phút.

– Bước thứ hai:
i) Cũng là 1 hỗn hợp dung dịch cho phản ứng PCR nói trên nhưng 1 μL mẫu là sản phẩm PCR của bước 1 và cặp mồi khác (SHIV-F2: 5′-CGG GAA ACG ATT CGT ATT GGG-3′ and SHIV-R2: 5′-TTG CTT GAT CGG CAT CCT TGA- 3′).ii) Chạy ở chu trình nhiệt: đầu tiên tháo xoắn ở 950C trong 3 phút, 950C trong 30 giây (35 vòng), 590C trong 30 giây và 720C trong 20 giây, 720C trong 2 phút.

* Phương pháp Real-time PCR:

– Cặp mồi và que dò cho DIV1-MCP qPCR (Qiu, 2020)
Phản ứng TaqMan mới được thiết lập sử dụng cặp mồi (142F/142R) hướng tới đoạn gen 142 bp của DIV1 MCP. Trình tự cặp mồi 142F: 5′- AAT CCA TGC AAG GTT CCT CAG G -3′ and 142R: 5′- CAA TCA ACA TGT CGC GGT GAA C -3′. Trình tự que dò TaqMan probe is 5′- CCA TAC GTG CTC GCT CGG CTT CGG -3′ được đánh dấu bằng 6-FAM ở đầu 5′ và TAMRA ở đầu 3′.

– Cặp mồi và que dò cho DIV1-ATPase qPCR (Qiu, 2018b)
Trong phản ứng TaqMan được báo cáo phía trên đã sử dụng cặp mồi (SHIV-F/SHIV-R) nhắm vào đoạn 188 bp của DIV1 ATPase gene. Trình tự cặp mồi là SHIV-F: 5’- AGG AGA GGG AAA TAA CGG GAA AAC-3’, SHIV-R: 5’- CGT CAG CAT TTG GTT CAT CCA TG-3’. Trình tự của que dò TaqMan: 5’- CTG CCC ATC TAA CAC CAT CTC CCG CCC-3’.
Phương pháp DIV1-ATPase qPCR không được khuyến cáo sử dụng làm bước thẩm định thứ 2 của phương pháp nested PCR, vì đoạn gen nhân lên có thể một phần bị trùng với trình tự đích của nested PCR.

– Quá trình nhân gen được thực hiện theo quy trình sau:
i) Nhân gen bằng Real-time PCR được thực hiện ở hệ thống phản ứng 20-μL gồm 10 μL 2× Master Mix (FastStart Essential DNA Probes Master mix, Roche), 500 nM mỗi 1 cặp mồi, 200 nM TaqMan que dò và 1μL DNA mẫu.

ii) Các bước PCR: 1 vòng 950C trong 10 phút gây biến tính, sau đó 40 vòng 950C trong 10 giây và 600C trong 30 giây đến 1 phút.
Các phương pháp này có thể phát hiện 1,2 bản sao DNA đích. Hai phương pháp Real time PCR này có thể thẩm định lẫn nhau. Độ nhạy và độ đặc hiệu lần lượt là 97,2% và 98,7%, khi DIV1-MCP qPCR được so sánh với DIV1-ATPase qPCR (Qiu et al., 2020).